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蛋白使用常见问题

 

蛋白使用常见问题

1、蛋白为什么要冻干?冻干对蛋白的影响有哪些?

答:蛋白质对热敏感,冻干能使绝大部分蛋白质的活性保留下来,提高蛋白的稳定性并延长保存时间,同时降低运费。

冻干有可能会造成蛋白的活性部分损失,聚集和其它变性问题。但可以通过添加保护剂(稳定剂,添加剂,辅料)和控制冻干的各种条件来尽可能降低这些负面的影响。

温馨提示:我公司提供的蛋白产品一般为冻干粉,它们在室温条件下非常稳定(至少1个月)。尽管如此,我们还是建议您在收到我们的产品后保存于-20℃ ,以确保蛋白100%的活性。

 

2、冻干前为什么向蛋白溶液中加保护剂?一般冻干保护剂有哪几种?你们的产品通常加的保护剂是什么?

答:保护剂是用来在冻干和储存过程中保护蛋白的。常用的保护剂或稳定剂有糖类,多元醇,聚合物,表面活性剂,某些蛋白和氨基酸等。我们通常加8%(质量比体积)的海藻糖和甘露醇作为冻干保护剂。海藻糖可明显阻止蛋白质二级结构改变以及冻干过程中蛋白质的伸展和聚集;甘露醇也是一种普遍应用的冻干保护剂和填充剂,可以降低某些蛋白的冻干后聚集情况。

温馨提示:对于大多数蛋白,重悬后在4℃仅能短期保存(约1周)。如想长期保存,请先配制成稀释液(其中必须含有载体蛋白,如0.1% BSA,5%HSA,或10% FBS),然后分装冻存于-20oC或-80oC。一定要避免反复冻融,因每次冻融均会引起蛋白的部分失活。

 

3、为什么我的管内几乎看不见蛋白产品?

答:武汉华美的蛋白产品中不含载体蛋白或其它添加物(如牛血清白蛋白(BSA),人血清白蛋白(HSA)和蔗糖等,并以最低含盐量的溶液进行冻干时,常常不能形成白色网架结构,而是微量的蛋白在冻干过程中沉积在管内,形成很薄或肉眼不可见的透明蛋白层。

温馨提示:在打开管盖前,我们建议您在小离心机中快速离心20-30秒,使附着在管盖或管壁上的蛋白聚集于管底。我们的质控步骤保证每管中所含的蛋白量准确无误,虽然有时您无法看到蛋白粉末,但管中的蛋白含量仍是非常精确的。

 

4、应如何确定细胞因子的种属交叉活性?

     答:1) 除少数例外,大多数人类细胞因子对小鼠细胞均有活性。2) 许多小鼠细胞因子也可作用于人类细胞,但比活性可能低于对应的人类细胞因子。 3) IL-7等为数不多的人类细胞因子作用于小鼠细胞时比对应的小鼠细胞因子活性更强。4) 干扰素,GM-CSF, IL-3和IL-4等细胞因子种属特异,对非同源细胞几乎没有活性。5) 相反,成纤维细胞生长因子(FGFs)和神经营养素(neurotrophins)高度保守,在不同动物种属细胞上均具有很好的活性。

 

5、应如何正确溶解重组蛋白产品? 

第1步:开盖前离心试剂管。冻干粉在运输过程中可能会因颠簸而漂散并粘贴于管壁或管盖上,所以在打开塑料瓶盖前,需将冻干粉通过离心收集到管底,以便用很小体积的液体即可将冻干粉完全溶解。一般需要3000-3500rpm离心5min,效果良好。

第2步:用无菌水重悬至0.1-1.0 mg/ml,不可振荡。这个步骤即为溶解步骤,非常重要。

1) 一定要用推荐的溶液重悬(或溶解)冻干粉。蛋白的溶解性与很多因素有关,其中比较重要的是pH值和离子强度。产品说明上所标明的溶解液是能够将该细胞因子或重组蛋白完全溶解的液体。如果您所用的溶解液的pH值和离子强度与说明书中所标明的不符,很多时候会造成细胞因子或重组蛋白不能完全溶解或者根本无法溶解,这样所配得的细胞因子或重组蛋白必然活性不够或丧失。

2) 一定要溶解到指定的浓度。蛋白在一定的浓度范围内可以保持良好的稳定性,这个范围就是说明书上所标明的浓度范围,一般为0.1-1.0 mg/ml。但这一浓度范围对于不同的重组蛋白是不同的。高于或低于该浓度范围时细胞因子或蛋白会不稳定,即很容易出现活性下降的现象。其次,高于这个浓度范围,可能会超过该蛋白的最大溶解浓度,即蛋白无法完全溶解。再者,高于或低于该浓度范围,蛋白可能会出现聚集(aggregation),最终结果还是部分蛋白未溶解,导致蛋白活性的减弱。

3) 一定不能振荡(vortex)。这里所说的振荡是指用涡旋仪进行快速振荡。请用放至室温的缓冲液作为溶剂。加缓冲液后,盖好瓶塞,轻轻用手翻转瓶子或把瓶子放在一个缓慢摇摆的摇床上。这样做来保证缓冲液能够接触到瓶子的整个内壁。 让瓶子在室温放置至少10 - 15分钟,然后可以进行分装或使用。

第3步:该重悬液在2-8oC最长可保存1周。

用说明书上推荐的溶液将细胞因子或重组蛋白重悬到推荐的浓度后,细胞因子或重组蛋白可放置在2-8oC,即冰箱的冷藏室。在这种条件下,细胞因子或重组蛋白的活性最长可保持1周。这对一个周期为5-7天的实验,如DC(树突状细胞)的诱导成熟是足够的。在此期间,只要每次从冰箱里吸取一定量的细胞因子或重组蛋白溶液加入到培养体系内即可。

其实,说明书上推荐的浓度对于一般的实验来讲是比较高的。所以用户通常会将该溶液进一步稀释后再放在4oC保存,待1周内用完。如进行稀释,必须遵照下面第4步的方法,即需用含载体蛋白的溶液进行稀释,否则稀释后的细胞因子或重组蛋白很容易会粘附在管壁或瓶壁上,使得溶液中的细胞因子或重组蛋白的浓度下降,细胞因子或重组蛋白的总活性则大为减弱。

第4步:如要长期保存,则需用含载体蛋白(如0.1% BSA,或10% FBS,或5% HSA)的溶液进一步稀释,然后分装冻存于-20oC至-80oC。

如果一个实验周期长于一周,或配制的细胞因子或重组蛋白一次用不完,我们就需对细胞因子或重组蛋白进行长期保存。方法是:将已重悬的细胞因子或蛋白用含载体蛋白,如0.1% BSA(牛血清白蛋白),10% FBS(胎牛血清),5% HSA(人血清白蛋白)的溶液将重悬液进一步稀释,然后分装冻存于-20oC至-80oC,即常规冰箱的冷冻室或超低温冰箱中。

在分装冻存前,一定要用含载体蛋白的溶液将重悬液进一步稀释。稀释后的细胞因子或重组蛋白可为任意浓度,因大量的载体蛋白可以保证低浓度细胞因子或重组蛋白仍然维持较高的稳定性。

即在做无血清培养或动物的体内实验时,细胞因子中不能含有BSA,FBS或HSA等动物或人的蛋白,要想长期保存细胞因子或重组蛋白则可用海藻糖(Trehalose)作为载体,用含海藻糖的溶液来稀释已重悬的细胞因子或重组蛋白,然后分装冻存。

 

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